ノックアウト実験基本実施プラン Basic Experiment Plan

 

黒字は発生工学研究会（以下NPO）側が、赤字は依頼者側に実施して頂きます。

  1. 【依頼者】ポジティブコントロールベクターと、ターゲティングベクターを作製する。但し、そのデザインについては、あらかじめNPOが確認したものであること。
  2. 【NPO】ポジティブコントロールベクターをES 細胞へ導入し、薬剤選択したコロニーからスクリーニングプライマー検定用ゲノムDNAを調整する。
  3. 【依頼者】短腕側プライマーを3種類程度準備し、PCRによるスクリーニングの条件を決定する。PCR酵素はKOD-FX（TOYOBO)をおススメします。
  4. 【NPO】ターゲティングベクターをES細胞に導入して薬剤選択を実施。約100クローンをピックアップして増殖、凍結保存すると同時にスクリーニング用ゲノムDNAを調整する。
  5. 【依頼者】3で設定したPCR条件により相同組換え体をスクリーニングする。
  6. 【NPO】相同組換えしたクローンを再培養し、凍結保存すると同時に確認用（長腕側、サザンブロッティング用）ゲノムDNAを調整する。
  7. 【依頼者】5のPCRを再確認すると同時に、長腕側のサザンブロッティングもしくはlong-PCRにより、短腕及び長腕の両側で正しく相同組換えがおこっていることを確認する。
  8. 【NPO】相同組換えしたES細胞の核型をチェックする。
  9. 【依頼者】インジェクションするクローンを3～4個程度選択する。
  10. 【NPO】ES細胞を胚盤胞期あるいは8細胞期の胚にインジェクションし、仮親に移植する。出産後は離乳まで飼育し、依頼者に引き渡す。
  11. 【依頼者】交配により生殖系列への寄与を確認し、ノックアウトマウスを作製する。