ES細胞への遺伝子導入と薬剤選択
ES細胞にはエレクトロポレーションによりターゲティングベクターを導入します。その後、薬剤選択を行い耐性クローンをピックアップし、増殖させた後、凍結保存すると共にゲノムDNAを抽出します。
相同組換えのスクリーニング
PCRで正しい相同組換えを起こしたES細胞クローンを判定します。PCRは簡便ですがprimerの選択が適当でなければ、スクリーニングは成功しません。そのため、ターゲティングベクターに用いた相同領域より外側を含むコントロールベクターを作り、ES細胞のゲノムに取り込ませたものを用いてPCR条件を設定することをお勧めしております。実験に当たっては、微生物病研究所の教員がアドバイスいたします。
サザンブロッティングによるスクリーニングにも対応できますが、まずはこちらまでお問い合わせください。
相同組換えの確認
稀に相同組換えクローンにランダム挿入クローンが混入することがありますが、PCRでは判定が難しいのでサザンブロッティングによる確認をお勧めしています。ベクターの外側をプローブとして5'-と3'-の両側を確認することが必要です（ベクター内部をプローブにすると、ランダム挿入されて偶然に同じサイズになることも少なくありません）。
